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冷凍溫度（cryo-TEM）下完全含水、未染色標(biāo)本的透射電子顯微鏡是結(jié)構(gòu)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)和其他科學(xué)分支的通用工具。通過將標(biāo)本放入冷凍劑中進(jìn)行超快速冷凍（沉浸式凍結(jié)）是一種常用的方法，用于制備在顯微鏡下檢查的各種標(biāo)本。本文是對沉浸式凍結(jié)基礎(chǔ)的補(bǔ)充，介紹了在不同領(lǐng)域使用沉浸冷凍標(biāo)本的三種冷凍TEM應(yīng)用。

病毒-膜相互作用

冷凍TEM的一項(xiàng)成熟應(yīng)用就是對孤立的大分子、病毒顆?；蚣?xì)絲進(jìn)行三維重建。一方面，這些方法基于重復(fù)結(jié)構(gòu)的平均化，通過大量相同的分子、細(xì)絲上的重復(fù)圖案或?qū)ΨQ來性減少冷凍TEM固有的干擾。另一方面，三維重建所需的這些復(fù)合體的不同視圖可以從（理想情況下）冰中顆粒的隨機(jī)方向或細(xì)絲的螺旋性獲得。

來自Max F. Perutz實(shí)驗(yàn)室（維也納）Dieter Blaas小組的Mohit Kumar對于鼻病毒顆粒和脂膜的相互作用以及產(chǎn)生顆粒內(nèi)吞作用的事件很感興趣^[1]。他們決定采用單顆粒重建方法來獲得顆粒與人工膜（脂質(zhì)體）對接的三維模型，并使用從許多顯微照片中選出的眾多單個病毒體/膜復(fù)合體。

為收集這類實(shí)驗(yàn)所需的大量顯微照片，或冷凍大量相似的標(biāo)本，結(jié)果的可重復(fù)性是一大關(guān)鍵因素，在這種情況下就是冰的厚度以及低限度污染。徠卡EM GP用獨(dú)特的傳感器解決了潮濕、彎曲濾紙或彎曲網(wǎng)格導(dǎo)致的吸液強(qiáng)度問題：傳感器能檢測到濾紙和樣本液滴接觸的瞬間并建立參考點(diǎn)。將濾紙從參考點(diǎn)向前移動預(yù)定的距離，各網(wǎng)格之間的壓力變化很小，如果使用相同的標(biāo)本、體積和時間，就能得到高度可重復(fù)的結(jié)果。

使用這種吸液傳感器，可以非常有效地從4µl樣品中獲得結(jié)果，只要該樣品涂抹在采用R1.2/1.3 Quantifoil薄膜的輝光放電400目Cu網(wǎng)格上，并允許在百分之九十九濕度和30°C的環(huán)境室下擴(kuò)散25秒。隨后，將吸液0.8秒并浸入液體乙烷。從利用300 kV冷凍TEM在這些冷凍和未染色標(biāo)本上采集的顯微照片中挑選出與類似直徑的脂質(zhì)體結(jié)合的顆粒（圖1）。從這些選定的顆粒中，作者計(jì)算了在沒有細(xì)胞受體的情況下病毒/膜組件的重建，模擬了脂質(zhì)膜在二十面體對稱二重軸上的緊密接觸，說明了病毒-膜緊密復(fù)合體的結(jié)合機(jī)制（圖 ）。

圖1：與脂質(zhì)體結(jié)合的普通感冒病毒的亞病毒顆粒的冷凍電子顯微照片，使用CCD攝像頭在300kV的低劑量條件下拍攝。左圖在焦點(diǎn)附近拍攝，分辨率更高，但噪點(diǎn)更多，右圖在更高的欠焦條件下拍攝（由維也納/奧地利MFPL實(shí)驗(yàn)室的Mohit Kumar和Dieter Blaas提供）。

圖2：通過對圖1所示顯微照片中提取的275個單獨(dú)顆粒的圖像進(jìn)行平均化計(jì)算，獲得的三位重建圖?？梢钥吹讲《九c膜的結(jié)合發(fā)生在接近二十面體對稱的二重軸之一處。脂質(zhì)雙層通過不對稱3DR定位，產(chǎn)生分辨率欠佳的病毒體；為了識別其軸，容積進(jìn)行對稱和疊加（由維也納/奧地利MFPL實(shí)驗(yàn)室的Mohit Kumar和Dieter Blaas提供）。

桿狀病毒肌動蛋白彗尾

維也納分子生物技術(shù)研究所J. Victor Small實(shí)驗(yàn)室的Jan Mueller及其同事^[2]使用冷凍電子斷層掃描技術(shù)對于桿狀病毒“彗尾”中的肌動蛋白細(xì)胞骨架進(jìn)行體內(nèi)和體外研究。這些肌動蛋白尾部由桿狀病毒和其他病原體形成核，以驅(qū)動它們前進(jìn)，這對于傳播感染至關(guān)重要。它們可以作為一種流行且易于訪問的模型系統(tǒng)來研究肌動蛋白細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白的作用。

對于由合成（且易于操作）“運(yùn)動性混合物”聚合的肌動蛋白尾部進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)，請勿在冷凍前將尾部移液到網(wǎng)格上，以防止操作造成損壞。恰恰相反，它們直接在200目Au網(wǎng)格上的Quantifoil R3.5/1穿孔碳膜上“生長”。在用10納米蛋白質(zhì)涂層膠體金作為電子斷層掃描對齊的基準(zhǔn)標(biāo)記補(bǔ)充樣品后，將其轉(zhuǎn)移到EM GP的加濕室。將樣品從背面吸液1.2至1.6秒，隨后通過浸入略高于冰點(diǎn)的液態(tài)乙烷中冷凍，并保存在液氮下直至裝入顯微鏡。為了減少背景，使用SerialEM以300 kV在穿孔碳膜的網(wǎng)孔上采集零損耗過濾傾斜系列，并使用IMOD離線重建（圖3）。

對于該研究的另一部分，Mueller和他的同事在活細(xì)胞的稀薄擴(kuò)散部分內(nèi)觀察到桿狀病毒的肌動蛋白彗尾，該部分可通過冷凍電子顯微鏡查看。由于引入了冷凍電子斷層掃描技術(shù)以及三維解析疊加結(jié)構(gòu)的能力，對該區(qū)域的研究得到了很大的推進(jìn)^[3]。

對于這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞在200目Au網(wǎng)格上培養(yǎng)，以消除銅離子的細(xì)胞毒性作用和電子斷層掃描中高傾斜度網(wǎng)格條的阻塞。使用多孔碳支持膜，例如Quantifoil R1/4。一旦細(xì)胞附著并擴(kuò)散，它們就會被化學(xué)固定并提取以清除細(xì)胞溶質(zhì)背景，從而能夠可靠地跟蹤單個細(xì)絲。隨后，用4µl補(bǔ)充有10nm蛋白質(zhì)飽和金顆粒的培養(yǎng)基覆蓋樣品，并轉(zhuǎn)移到百分之九十五相對濕度的EM GP環(huán)境室中。這些樣品從徠卡EM GP上的吸液器設(shè)計(jì)大大獲益：由于單側(cè)吸液，多余液體僅從網(wǎng)格背面吸走，避免敏感細(xì)胞單層和濾紙之間的直接接觸。使用預(yù)加濕Whatman 1號濾紙進(jìn)行1.5至2.0秒的吸液可產(chǎn)生較好效果，并使用C膜上的孔來獲得整個網(wǎng)格的均勻冰層厚度。吸液后，立刻將樣品浸入液態(tài)乙烷中。按照上述要求獲取并處理斷層掃描數(shù)據(jù)（圖4）。

a)

b)

c)

圖3：桿狀病毒肌動蛋白彗尾的體外冷凍電子斷層掃描。a) 含有肌動蛋白、Arp2/3復(fù)合體、凝溶膠蛋白、絲切蛋白和VASP的運(yùn)動性混合物中，在去包膜的純化桿狀病毒上形成的彗尾的體外冷凍電子斷層掃描切片（11nm）。插圖顯示了概覽圖像中正方形的分支連接點(diǎn)的詳細(xì)信息。b) 來自斷層掃描的模型，綠色表示肌動蛋白細(xì)絲，紅色表示分支連接點(diǎn)。c) 模型特寫，突出顯示與病毒后部相鄰的黃色細(xì)絲。網(wǎng)格條（a, b），100nm；c) 25nm；插圖，10nm（Mueller J et al.：桿狀病毒肌動蛋白彗尾的電子斷層掃描和模擬支持病原體推進(jìn)的栓系細(xì)絲模型。PLoS Biol.12 [1]: e1001765, Figures a–c; doi: 10.1371/journal.pbio.1001765.g005)。

a)

b)

圖4：體內(nèi)桿狀病毒肌動蛋白彗尾的冷凍電子斷層掃描。a) B16 黑色素瘤細(xì)胞中桿狀病毒彗尾的冷凍電子斷層照片。圖像顯示了斷層照片的19nm部分。由于病毒尾部與冰層不在一個平面，因此斷層照片顯示為三個圖像，由白線分隔，在不同的z水平上拍攝。插圖顯示了概覽圖像中正方形分支連接點(diǎn)的詳細(xì)信息。b) 完整彗尾模型后部的投影，宿主細(xì)胞骨架（半透明）的肌動蛋白細(xì)絲以及一條微管（灰管）疊加。網(wǎng)格條 a)，100nm（Mueller J et al.: 桿狀病毒肌動蛋白彗尾的電子斷層掃描和模擬支持病原體推進(jìn)的栓系細(xì)絲模型。PLoS Biol.12 [1]: Figures 3a + d; doi: 10.1371/journal.pbio.1001765.g003)。

藥物納米載體

沉浸式凍結(jié)和冷凍TEM不僅是結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生物學(xué)中不可或缺的工具，而且對于在自然狀態(tài)下對藥理學(xué)樣本進(jìn)行成像也非常有用（有關(guān)評論，參見^[4]）。一項(xiàng)研究^[5]使用沉浸冷凍標(biāo)本的冷凍TEM來闡明用于皮膚給藥的不同超聲工程納米載體的超微結(jié)構(gòu)：可以看到固體脂質(zhì)納米顆粒、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，和納米乳液。

這些實(shí)驗(yàn)的樣品在徠卡EM GP上冷凍，儀器在室溫和百分之九十五rH的環(huán)境室中運(yùn)行。從一系列預(yù)測試中獲得每個標(biāo)本在雙蒸水中的較好稀釋度，以產(chǎn)生密度良好的標(biāo)本，確保各個結(jié)構(gòu)之間沒有太多重疊。將4µl標(biāo)本覆蓋到涂有穿孔碳膜的輝光放電400目EM網(wǎng)格上。經(jīng)過沉降后，根據(jù)使用的配方，對懸浮液吸液1.25-4.0秒。使用標(biāo)準(zhǔn)Whatman 1號濾紙和儀器的吸液傳感器，吸液后立即將樣品浸入液態(tài)乙烷中。

雖然來自冷凍TEM的尺寸信息與從動態(tài)光散射獲得的數(shù)據(jù)互補(bǔ)，但結(jié)構(gòu)信息是冷凍TEM數(shù)據(jù)，并且各個標(biāo)本之間呈現(xiàn)出的巨大差異，包括從球形液滴到扁平的片狀結(jié)構(gòu)（圖5）。請注意此處顯示的顯微照片中沒有污染，這是因?yàn)镚P中集成了快速處理和一些防污染措施：這包括負(fù)壓環(huán)境和初級冷凍劑中強(qiáng)大的“TF”蒸發(fā)器，它會產(chǎn)生干燥的低溫氮?dú)猸h(huán)境，以保護(hù)標(biāo)本免受升溫和污染。

圖5：納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體 (NLC)、納米乳液 (NE) 和固體脂質(zhì)納米顆粒 (SLN) 的冷凍電子顯微鏡圖像（Schwarz JC et al: 皮膚給藥的納米載體：制備方法、載體類型和流變性能的影響。International Journal of Pharmaceutics 437: 83–88 [2012], Fig. 2）。

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