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冷凍電子斷層掃描(CryoET)用于分辨細胞環(huán)境內(nèi)的生物分子，分辨率達到亞納米級，為研究分子社會學(xué)開啟了一扇窗。在這一尺度下，僅通過形狀就可以識別各個蛋白質(zhì)，而不需要任何標記。但是，亞納米分辨率下的成像伴隨著一個重大的挑戰(zhàn)：您需要找到并準確定位感興趣的部位。

徠卡顯微系統(tǒng)提供冷凍電子斷層掃描解決方案，使用冷凍光學(xué)顯微鏡進行快速、高分辨率的成像和準確的圖像數(shù)據(jù)傳輸，同時在整個工作流程中保持至佳的冷凍條件。

什么是冷凍電子斷層掃描？

使用冷凍電子斷層掃描（也稱為電子斷層掃描），可以在原生和功能狀態(tài)下以三維分子分辨率分析蛋白質(zhì)間相互作用。樣本在一系列受控的位置上傾斜時，會成像為一系列的二維圖像。由此產(chǎn)生的圖像“切片”可以組合起來，生成樣本的三維重建圖像。

典型的CryoET工作流程中有哪些挑戰(zhàn)？

在典型的CryoET工作流程中，至大挑戰(zhàn)是難以確定包含要成像的細胞或蛋白質(zhì)的準確感興趣區(qū)域。目標定位反復(fù)失敗會導(dǎo)致過程非常耗時，至終浪費昂貴的電子顯微鏡(EM)成像時間。工作流程中的另外兩個挑戰(zhàn)包括確保樣本質(zhì)量和冰層厚度始終如一，以及在將樣本傳送到冷凍透射電鏡之前使樣本保持充分玻璃化。

CryoET工作流程包含哪些步驟？

該技術(shù)涉及樣本的制備，樣本在電子顯微鏡載網(wǎng)上，然后迅速陷入液氮中冷凍，使樣本玻璃化，防止冰晶形成。

為了進行高分辨率的冷凍斷層掃描，成像的標本切片厚度不應(yīng)大于300納米。為了觀察樣本的“較厚”部分（如細胞體），須將樣本減薄。除了冷凍超薄切片技術(shù)外，使用專門或多模態(tài)的冷凍掃描電子顯微鏡進行聚焦離子束(FIB)研磨是一種方法。兩個離子束窗口的定位應(yīng)確保在感興趣區(qū)域內(nèi)形成厚度大約200納米的薄冰片（薄片），以便進行冷凍電鏡電子斷層掃描。

現(xiàn)在可以用冷凍透射電子顯微鏡掃描制備的樣本，然后須進行數(shù)據(jù)重建過程，將二維圖像重建為單一的三維模型。

如何用冷凍光學(xué)顯微鏡克服冷凍電子斷層掃描(CryoET)的挑戰(zhàn)？

冷凍光學(xué)顯微鏡可以在兩個重要方面對CryoET工作流程做出積極貢獻。

首先，光學(xué)顯微鏡有助于評估樣本的質(zhì)量。使用冷凍光學(xué)顯微鏡可以快速了解樣本的冷凍質(zhì)量和冰層厚度，以及樣本的分布是否適合進一步處理。徠卡的冷凍解決方案可確保樣本在這些步驟中保持安全和活性。

其次，在提高工作流程效率方面，冷凍光學(xué)顯微鏡的至大潛力是能夠在啟動時間和成本密集型的冷凍電鏡制備工作之前，更加準確地定位感興趣的結(jié)構(gòu)。徠卡的冷凍光學(xué)顯微鏡解決方案能夠?qū)⒛繕私Y(jié)構(gòu)的圖像和坐標輸出到后續(xù)的電鏡步驟，從而顯著縮短電鏡成像時間。

一個完整載網(wǎng)的焦面總覽，有不同的模式來識別載網(wǎng)缺陷、對齊標志和目標分布。HeLa細胞由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實驗室Mahamid團隊的Ievgeniia Zagoriy提供。藍色–Hoechst，細胞核；綠色–MitoTracker Green，線粒體；紅色–Crimson熒光珠和Bodipy，脂滴。一個載網(wǎng)方格的邊緣長度：90微米，比例尺寬度：35微米。完整載網(wǎng)直徑：3毫米

Coral Cryo簡介：迄今至有效的CryoET工作流程

徠卡提供專用的三維冷凍電子斷層掃描工作流程解決方案，可確保樣本活性、進行質(zhì)量檢查，至重要的是確保三維目標定位機制準確可靠，從而克服各種典型的挑戰(zhàn)。我們優(yōu)化的硬件（包含冷凍臺和傳送梭）配合CryoET目標定位軟件，以及適用于冷凍聚焦離子束(FIB)或真空冷凍傳送(VCT)載物臺的各種無縫集成和傳送選項。

萊茵衣藻，兩種不同類型的鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白IFT-NeonGreen和IFT-mCherry。樣本由德國德累斯頓馬克斯-普朗克分子細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)研究所的Pigino實驗室提供。

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